Nous vous accompagnons dans toutes les étapes de vos projets scientifiques en génomique fonctionnelle à haut débit : étude de faisabilité, accompagnement pour vos demandes de financement, conseils de design expérimental, prise en charge des échantillons, formation et utilisation des équipements accessibles sur réservation.
La plateforme est équipée d’un séquenceur haut débit NextSeq 2000 (Illumina).
Pour les applications ci-dessous, nous préparons et séquençons vos librairies en effectuant des contrôles qualité à chaque étape.
Nous pouvons également séquencer vos propres librairies dans la mesure où elles sont compatibles avec la technologie Illumina.
La plateforme ne réalise pas l’extraction des acides nucléiques → Consultez ci-dessous les préconisations pour la préparation et l’envoi de vos échantillons selon les applications.
Vous avez un projet nécessitant une autre application, nous sommes à votre écoute, n’hésitez pas à nous contacter → Contactez nous
RNAseq
L’extraction des ARN ainsi que leur contrôle quantificatif et qualitatif ne sont pas assurés par la plateforme. Afin d’obtenir des ARN de bonne qualité nous vous recommandons d’utiliser des protocoles d’extraction sur colonnes avec membrane de silice ou billes magnétiques (Qiagen, Macherey Nagel …) et pas de Trizol ni phénol-chloroforme.
La qualité des ARN doit impérativement être validée par une électrophorèse haute résolution (Bioanalyzer, Tapestation, Labchip GX). Le RIN (RNA Integrity Number) doit être supérieur ou égal à 7.
Toutefois, il existe des kits spécifiques permettant la préparation de librairies à partir d’ARN dégradés issus de tissus FFPE.
Les protocoles de préparation de librairies dépendent de la quantité d’ARN total disponible ainsi que du type d’ARN à étudier → Contactez nous pour planifier vos expériences.
Options de séquençage du NextSeq 2000
Chaque flow cell peut être utilisée pour séquencer en single read (SR) ou paired-end (PE).
Par exemple une flow cell P2 100bp permet de séquencer 100bp en SR ou 2 x 50bp en PE.
Nos équipements de tri cellulaire (GentleMacs, Tyto, MacsQuant16) sont accessibles pour la préparation de vos échantillons → Réserver ou Nous contacter
Overview des étapes d’un protocole RNAseq
Source : Shudagar et al., 2017
Single Cell/Single nuclei RNAseq
La plateforme est équipée d’un Chromium iX (10X Genomics) et propose du 3’ mRNA-seq sur cellules ou noyaux uniques en associant la technologie NextGEM de 10X Genomics avec le séquençage haut débit sur NextSeq 2000 (Illumina).
Le Single-Cell RNAseq (ScRNASeq) et Single-Nuclei RNAseq (SnRNAseq) permettent de prendre en compte l’hétérogénéité cellulaire et de caractériser des populations cellulaires rares en analysant l’expression des gènes cellule par cellule ou noyau par noyau.
La technologie NextGEM est basée sur la microfluidique digitale permettant de manipuler des fluides dans des microcanaux et d’encapsuler des cellules/noyaux avec des réactifs dans des microgouttelettes d’huile qui vont se comporter comme des microréacteurs.
Le protocole permet de préparer des librairies d’ADNc contenant un code-barre à l’extrémité 3’ à partir des ARNm contenus dans chaque cellule/noyau. Le principe repose sur l’encapsulation d’une cellule/noyau dans une gouttelette d’huile de quelques nanolitres qui renferme une bille, appelée GEM (Gel Bead-In EMulsions), sur laquelle sont fixés des oligonucléotides polydT pour capturer les ARNm par leur queue polyA. L’unicité est donnée par l’utilisation d’un code-barre spécifique à chaque bille et donc à chaque cellule. Afin de permettre l’analyse à l’échelle de la cellule unique, les cellules sont dispensées par dilution limite de manière à ce que 90-99% des GEMs ne contiennent aucune cellule et le reste majoritairement une seule cellule.
Schéma de la technologie NextGEM (10X Genomics)
Source : 10X Genomics
Schéma d’une bille GEM
Source : 10X Genomics
Chaque GEM est recouverte de séquences adaptatrices uniques contenant un code-barre, un UMI et la séquence PolyT. Le code-barre est l'identifiant unique à la bille, et donc unique à la cellule. 10x Genomics propose 750 000 barres-codes environ. L'UMI (Unique Molecular Identifiers) est une courte séquence aléatoire unique à chaque fragment entourant la bille. Il y a donc plusieurs UMI par bille. Cet identifiant est utilisé pour éviter les biais d'amplification.
Immédiatement après la formation des GEMs, le gel est dissout, les réactifs libérés et la cellule lysée. La réaction de reverse-transcription est réalisée dans les gouttes qui se comportent comme des microréacteurs. Les GEMs sont ensuite cassés, tous les ADNc poolés et les étapes d’amplification pour fabriquer les librairies sont réalisées en tube. Les librairies sont ensuite purifiées et séquencées.
Contactez nous pour planifier vos expériences.
Nos équipements de tri cellulaire (GentleMacs, Tyto, MacsQuant16) sont accessibles pour la préparation de vos échantillons et leur contrôle qualité → Réserver ou Nous contacter
Nous réalisons la préparation des librairies, le séquençage et l’analyse primaire des données avec CellRanger.
La préparation des suspensions cellulaires/noyaux est assurée par le porteur de projet.
La qualité de la suspension cellulaire/noyaux est déterminante pour le succès du projet ScRNAseq/SnRNAseq.
La présence de débris et de cellules mortes impacte le taux d’encapsulation, le taux de viabilité cellulaire doit être supérieur à 70% → Consultez les recommandations pour la préparation de cellules (Sample-Prep-Cells) ou de noyaux (Sample-Prep-Nuclei)
Le nombre de cellules en entrée dépend du nombre de cellules que vous souhaitez analyser, le taux d’encapsulation moyen est de 40-60%. Attention, plus le nombre de cellules/noyaux est élevé plus le taux de multiplets par goutte sera élevé (cf tableau ci-dessous). Il n’est pas recommandé d’encapsuler plus de 5000 cellules par puits.
10X Genomics recommande une concentration de 700-1200 cellules/µl dans une solution de 1X PBS-0.04% BSA.
Source : 10X Genomics
Le Chromium iX permet également de travailler à partir de cellules fixées à la PFA en utilisant le protocole Single Cell Gene Expression Flex, pour des échantillons humains ou murins → Consultez single-cell-gene-expression-flex
Source : 10X Genomics
Librairies prêtes à séquencer
Contactez nous pour planifier le run et l’envoi de vos échantillons.
Les contrôles Qualité seront effectués à réception et les librairies purifiées en cas de besoin
Informations à nous transmettre pour le séquençage :
- Kit utilisé pour la préparation des librairies
- Concentration et taille des librairies
- Noms des échantillons et index utilisés
- Paramètres de séquençage souhaités (SR, PE, longueur des reads, profondeur de séquençage, % PhiX…)
Options de séquençage du NextSeq 2000
Chaque flow cell peut être utilisée pour séquencer en single read (SR) ou paired-end (PE).
Par exemple une flow cell P2 100bp permet de séquencer 100bp en SR ou 2 x 50bp en PE.
Spatial Transcriptomics
